A mastite é definida como uma inflamação da glândula mamária, seguida por uma infecção bacteriana, considerada uma patologia complexa, de caráter multifuncional e bastante difundida nos rebanhos leiteiros, sendo o principal patógeno responsável o Staphylococcus aureus. Como alternativa para tratamento de infecções oriundas por microrganismos, surge a inativação fotodinâmica de microrganismos (IFMO), que visa na combinação de luz, fotossensbilizador (FS) e oxigênio molecular, os quais juntos produzam espécies reativas de oxigênio (EROs), que causam a morte celular do alvo. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi de avaliar o uso de filmes poliméricos associado ao fotossensbilizador safranina na IFMO em cepas de Staphylococcus aureus. Foram preparadas quatro formulações de filmes poliméricos associados ou não com a safranina, sendo poli (álcool vinílico) (PVA), poliacrilato de sódio e safranina (formulação 1), PVA e poliacrilato de sódio (formulação 2), PVA e safranina (formulação 3) e PVA (formulação 4), sob irradiação (1 e 5 minutos) ou não da luz LED verde 5mm (λ = 520nm) acoplada a um frasco aplicador dipping, com potência ótica de 64mW, levando a uma dose de energia de 19,2J/cm2. A atividade antimicrobiana foi realizada seguindo o protocolo da farmacopeia brasileira, utilizando a cepa de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), sendo preparadas diluições seriadas (10-2 e 10-3) em duplicata e adicionado 100 microlitros de cada diluição na superfície de placas contendo ágar nutriente. O período de incubação foi de 35 ± 2º C por 24 horas e realizada a contagem do número de unidades formadoras de colônias (UFC). Os dados obtidos in vitro foram analisados sob delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial (2x3x2) por meio da técnica de modelos generalizados lineares, sendo realizado dois ensaios com a combinação de duas formulações cada, totalizando quatro tratamentos com seis repetições dentro de cada combinação e com três tempos de irradiação e para a comparação de médias foi utilizado o teste de Tukey com significância de 5%, usando o software R versão 4.3.1. A formulação 1 teve inibição total no crescimento microbiano sem ou com a presença da luz, sendo diferente no tempo de 1 minuto nas diluições 1 (10-2) e 2 (10-3). Já para a formulação 2, em todos os níveis de exposição à luz (0, 1 e 5 minutos) e na ausência de luz, houve crescimento microbiano, porém no menor tempo foi observado redução da carga bacteriana na diluição 2. Na formulação 3, não foi observado crescimento microbiano tanto na ausência quanto na presença de luz e independente da diluição, em contrapartida na formulação 4 foi houve crescimento bacteriano nos três tempos de exposição (0, 1 e 5 minutos), tendo uma redução da contagem de microrganismos no tempo de 1 minuto. Conclui-se que os filmes poliméricos quando associados com a safranina na ausência de luz inibem o crescimento de Staphylococcus aureus, não necessário o uso da luz, sendo assim, uma alternativa para a prevenção da mastite.