As secreções das glândulas paratóides (SGP) dos sapos, constituídas por alcaloides, diácidos de arginina, bufadienolídeos, bufotoxinas, peptídeos e proteínas, apresentam várias atividades biológicas comprovadas, tais como: citotóxica, antibacteriana, antifúngica, antiviral e antimalárica. Apesar dos bufadienolídeos serem considerados os principais componentes bioativos destas secreções, não existe na literatura um método analítico para a quantificação de bufadienolídeos totais em secreções paratóides de sapos. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo investigar o perfil metabolômico das secreções paratóides dos sapos Rhinella diptycha e Rhinella granulosa, avaliar a toxicidade e os potenciais citotóxico, antibacteriano, antifúngico, anticolinesterásico, moluscicida, cercaricida e larvicida destas secreções, bem como desenvolver e validar o primeiro método para quantificação de bufadienolídeos totais em amostras de secreções glandulares de anuros, utilizando a técnica de espectrofotometria de absorção no UV-Vis. Foram identificados 23 constituintes nas SGP de R. diptycha e 50 metabólitos nas SGP de R. granulosa por UPLC-QToF-MS/MS. Nas secreções paratóides de R. diptycha, as maiores quantidades de metabólitos foram evidenciadas nas fêmeas, em SGP obtidas durante a estação seca e coletadas na cidade de Teresina. Dos doze extratos de R. diptycha, sete exibiram potencial citotóxico frente as células tumorais da próstata, três apresentaram atividade antibacteriana contra Escherichia coli, dois apresentaram atividade moluscicida frente ao caramujo Biomphalaria glabrata, um reduziu totalmente a viabilidade das cercárias de Schistosoma mansoni, um apresentou atividade contra as larvas de Aedes aegypti e nenhum deles inibiu o crescimento dos fibroblastos murinos. O extrato de R. granulosa apresentou citotoxicidade frente às linhagens tumorais do sistema nervoso central e de próstata, potencial antibacteriano promissor contra Staphylococcus aureus e potencial para inibição da enzima acetilcolinesterase, não inibindo o crescimento dos fibroblastos. O método desenvolvido apresentou seletividade, robustez, ampla linearidade, baixos limites de detecção e quantificação e taxas de recuperação do padrão, repetibilidade e reprodutibilidade atendendo às recomendações da Conferência Internacional de Harmonização. Além disso, é inovador, simples, rápido, preciso e de baixo custo. Este estudo apresenta informações inéditas sobre as SGP investigadas, oportuniza pesquisas futuras sobre outras questões observadas, amplia o conhecimento sobre as espécies R. diptycha e R. granulosa e contribui para o desenvolvimento da anurofauna do estado do Piauí.