A papaína (carica papaya), uma enzima proteolítica, foi covalentemente imobilizada nos suportes híbridos contendo nanopartículas de óxido de zinco (ZnO NPs) e quitosana (S1- ZnO/quitosana) e em nanopartículas de magnetita (Fe3O4 Nps), e quitosana (S2-Fe3O4/quitosana). Cristalinidade, organização e estrutura foram investigadas por difração de raios-X (DRX), espectroscopia eletrônica e vibracional nas regiões do UV-Vis e infravermelho com transformada Fourier respectivamente. Os planos cristalográficos para a fase hexagonal do tipo wurtizita foram observados para as ZnO NPs, S1, e S1-Papaína bem como os picos referentes a estrutura cúbica de espinélio invertido das Fe3O4 NPs nos difratogramas das Fe3O4 NPs, S2 e S2-papaína . Os espectros eletrônicos apresentaram máximos de absorção no UV-Vis em 371 nm para as ZnO NPs, 377 nm para S1 e 192 e 352 nm S1-papaína referentes as transições d-d, e n→π* relativas às ZnO NPs e papaína, respectivamente. Para as Fe3O4 NPs o aumento na absorção em 345 nm indica a formação destas. O espectro de FTIR para as ZnO NPs apresentou o estiramento de elevada intensidade em 497 cm-1 referente a νZn-O confirmando a formação das ZnO NPs, para as Fe3O4 NPs o estiramento em 585 cm-1 foi atribuído a νFe-O. Os suportes S1 e S2 apresentaram as vibrações e estiramentos característicos da quitosana e das ZnO NPs e Fe3O4 NPs respectivamente, já nos espectros de FTIR para a papaína imobilizada tanto em S1 como em S2 pode se observar, além das bandas características da quitosana, da papaína, das ZnO NPs (para S1-papaína) e das Fe3O4 NPs (para S2-papaína) uma aumento na absorbância na banda em 1655 cm -1, para S1-papaína e em 1645 cm-1, para S2-papaína, podendo ser um indicativo da formação da ligação N=C, confirmando a imobilização da papaína nos suportes propostos. Todas as análises confirmam a formação das ZnO NPs, das Fe3O4 NPs, dos suportes S1 e S2 bem como a imobilização da papaína. Os ensaios farmacológicos realizados com S1-papaína mostraram que a enzima imobilizada em ZnO NPs possui baixa citotoxicidade em macrófagos (CC50 = 488,354 μg·mL-1), sendo citotóxica apenas nas concentrações mais elevadas, e em eritrócitos. Além disso a enzima imobilizada provoca um aumento na capacidade fagocítica dos macrófagos em baixas concentrações e diminui este parâmetro em concentrações elevadas. Os materiais desenolvidos mostram-se promissores para o uso na castração química de animais, entretanto mais estudos devem ser realizados.