O uso de herbicidas é importante para o controle de ervas daninhas nas lavouras. No entanto, eles podem apresentar impactos nas propriedades do solo, como propriedades biológicas. Neste estudo, avaliamos as respostas da atividade da biomassa microbiana e enzimas do solo à aplicação dos herbicidas imazethapyr e flumioxazin e sua mistura em um experimento em condições de laboratório, utilizando solos com histórico de uso diferente. A biomassa microbiana do solo C (MBC) diminuiu, enquanto a biomassa microbiana N (MBN) não foi afetada após a aplicação dos herbicidas em comparação ao controle. A atividade da respiração do solo, quociente respiratório e desidrogenase (DHA) aumentou significativamente após a aplicação dos herbicidas em comparação ao controle. A hidrólise do diacetato de fluoresceína (FDA) não foi significativamente diferente entre os tratamentos controle e herbicida. A curva de resposta principal mostrou os maiores efeitos iniciais para a flumioxazina, seguida pelo imazethapyr e sua mistura. A flumioxazina teve uma influência diferente na respiração do solo e no quociente respiratório do que o imazethapyr e sua mistura. Finalmente, os efeitos dos herbicidas na biomassa e enzimas microbianas do solo são de curto prazo, pois observamos recuperação dos parâmetros biológicos ao longo do tempo.