O câncer é um grande problema de saúde pública no mundo e tem como principal característica a proliferação celular descontrolada. Muitos são os esforços na busca de novos compostos efetivos no tratamento do câncer e as chalconas sulfonamidas ultimamente tem se destacado como promissoras devido ao seu potencial anticâncer. Porém, ainda são escassos os estudos relatando sua atividade citotóxica e citostática. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito citotóxico da chalcona sulfonamida sintética 99 (CSS99) e os mecanismos envolvidos na sua atividade antiproliferativa, por meio de ensaios in vitro. A chalcona sulfonamida 99 foi testada em linhagens tumorais e não tumorais pelo método de MTT. Os resultados demonstraram a atividade da CSS99 frente a 6 linhagens de células tumorais e 2 células não tumorais. O composto em estudo apresentou uma melhor resposta frente a linhagem de carcinoma colorretal humano (HCT-116), obtendo CI50 de 3,65 μM. A partir desse resultado, decidiu-se avaliar a atividade citotóxica da CSS99 nesta mesma linhagem, em três tempos diferentes (24, 48 e 72 horas), usando o método de MTT. Os resultados apontaram que a CSS99 age de maneira concentração tempo-dependente. Pelo ensaio de exclusão de tripan, a CSS99 apresentou diminuição de células viáveis e aumento de células inviáveis quando se aumenta a concentração nos tempos de 24 e 48 horas, confirmando os efeitos previamente observados por MTT. Assim, a técnica de citometria de fluxo foi utilizada para auxiliar a desvendar o mecanismo de ação da CSS99. Nessa técnica foi usado o iodeto de propídeo para avaliação da integridade de membrana e o perfil do ciclo celular. Não houve alteração na integridade da membrana nos tempos de 24 e 48 horas, nas concentrações de 2 e 4 μM e apenas a concentração de 8 μM apresentou uma redução na integridade da membrana significativa das células HCT-116, quando comparada ao controle negativo. Quanto a análise do ciclo celular, a CSS99 induziu um aumento no percentual de células na fase G2/M, com destaque para a concentração de 4 μM no tempo de 24 horas. Posteriormente foi utilizado outro corante, Rodamina 123, para mensurar o potencial transmembrânico mitocondrial. Notou-se uma alteração logo nas primeiras 24 horas analisadas, destacando-se a concentração de 8 μM, que causou despolarização significativa quando comparada ao controle negativo. A fragmentação do DNA foi mensurada por citometria de fluxo e observou-se que apenas a concentração de 2 μM de CSS99 não causou fragmentação significativa nos tempos observados. A partir da técnica de FTIR pode-se notar a presença de bandas específicas demonstrando as características celulares e indicativas de morte celular. Os ensaios morfológicos utilizando microscopia óptica e microscopia de força atômica permitiram a visualização da morfologia das células HCT-116, evidenciando diferenças no perfil de forma e tamanho, quando comparadas ao controle negativo. Também foi realizado o ensaio de western blot para avaliar a expressão de proteínas relacionadas ao processo de morte celular e houve a ativação de p-H2AX, p-p53 e caspase 3, o que corrobora com os dados anteriores. Para análise da influência do p53 nos efeitos observados da molécula em estudo, foi realizado um MTT utilizando a HCT-116 p53-/-, que juntamente com o western blot, sugerem que o mecanismo de citotoxicidade ocasionado pela CSS99 tem o envolvimento do gene p53. Podemos concluir que a chalcona sulfonamida sintética teve um promissor efeito citotóxico, demostrando atividade seletiva para linhagens de carcinoma colorretal humano (HCT-116). A partir dos dados apresentados podemos sugerir que seus efeitos podem estar relacionados a função do gene p53, o qual pode influenciar os efeitos da molécula CSS99 sobre o perfil do ciclo celular, dano ao DNA e apoptose celular. No entanto, novos estudos devem ser realizados com objetivo de aprofundar o mecanismo de ação da molécula.