A busca por aditivos naturais e sustentáveis para aplicação na nutrição animal tem crescido significativamente nos últimos anos, especialmente diante da necessidade de reduzir o uso de promotores de crescimento sintéticos e melhorar a eficiência produtiva na avicultura. Nesse contexto, enzimas proteolíticas de origem vegetal têm despertado interesse biotecnológico devido à sua capacidade de atuar na digestibilidade de nutrientes, além de apresentarem potencial antioxidante, antimicrobiano e bioativo. A Ora-pro-nóbis (Pereskia aculeata), planta alimentícia não convencional amplamente distribuída no Brasil, destaca-se pelo elevado teor proteico e pela presença de compostos bioativos, sendo considerada uma fonte promissora para obtenção de biomoléculas de interesse industrial e agropecuário. Dessa forma, o objetivo desta dissertação foi obter, purificar, caracterizar bioquimicamente e avaliar o potencial de aplicação de uma protease extraída das folhas de Ora-pro-nóbis (Pereskia aculeata) como aditivo enzimático na alimentação de frangos de corte da linhagem Pescoço Pelado. Inicialmente, as folhas de Ora-pro-nóbis foram coletadas, secas, trituradas e submetidas à extração proteica em diferentes condições experimentais. Os extratos obtidos foram avaliados quanto ao teor de proteínas e à atividade proteásica. A condição de extração mais eficiente foi obtida utilizando solução de NaCl 0,15 M durante 360 minutos, proporcionando maior atividade enzimática e demonstrando a eficiência de soluções salinas na solubilização de proteínas vegetais. Em seguida, a protease selecionada foi purificada por sistema de duas fases aquosas (PEG/fosfato), sendo as variáveis do processo otimizadas por planejamento fatorial. Os resultados evidenciaram que a concentração de sal, a massa molar do PEG e o pH influenciaram significativamente a partição, recuperação e fator de purificação da enzima. A condição composta por PEG 8000, pH 6 e 12% de sal apresentou os melhores resultados de purificação. Posteriormente, a enzima purificada foi caracterizada quanto à estabilidade frente a diferentes condições de pH, temperatura, íons metálicos e inibidores. A protease apresentou elevada estabilidade térmica a 40 °C e ampla faixa de estabilidade em pH (3–11), além de comportamento variável na presença de íons metálicos e inibidores específicos. Também foi realizada avaliação de citotoxicidade em linhagens celulares, na qual a enzima apresentou baixa toxicidade em células normais e efeito citotóxico significativo em células tumorais, indicando potencial biotecnológico promissor. Após a caracterização, o extrato enzimático foi liofilizado e incorporado à alimentação de 80 frangos de corte machos de crescimento lento da linhagem Pescoço Pelado, distribuídos em delineamento inteiramente casualizado com dois tratamentos: dieta controle e dieta suplementada com 300 U/g de extrato enzimático. Foram avaliados parâmetros de desempenho zootécnico e bioquímicos séricos das aves. Os resultados demonstraram redução significativa no consumo de ração e no ganho de peso das aves suplementadas, sem alterações na conversão alimentar e na viabilidade. Em relação aos parâmetros bioquímicos, observou-se redução nos níveis séricos de glicose e albumina, além do aumento nas concentrações de colesterol total, sem alterações significativas nos níveis de triglicerídeos, proteína total e fosfatase alcalina. Os resultados sugerem que os compostos bioativos e fatores antinutricionais presentes em Pereskia aculeata podem influenciar o metabolismo energético e proteico das aves, sem evidências de toxicidade sistêmica ou comprometimento da homeostase fisiológica. Além disso, as condições ambientais observadas durante o experimento indicaram ocorrência de desafio térmico, fator que pode ter contribuído para as respostas metabólicas e produtivas observadas. Conclui-se que a protease de Ora-pro-nóbis apresenta potencial como alternativa biotecnológica sustentável e inovadora para aplicação na alimentação de frangos de corte, sendo necessária a definição de níveis adequados de inclusão capazes de equilibrar seus efeitos bioativos e o desempenho produtivo das aves.