Uma banca de DEFESA de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE: CAROLINE DE JESUS SOUSA
DATA: 03/05/2024
HORA: 14:00
LOCAL: Auditório do Núcleo da Pós-Graduação do CCA
TÍTULO: DETECÇÃO DE METALOPEPTIDASES TIPO GP63 EM Leishmania infantum RECUPERADAS DE GATOS NATURALMENTE INFECTADOS
PALAVRAS-CHAVES: Leishmaniose Visceral; Felinos; peptidase, leishmanolisina
PÁGINAS: 62
GRANDE ÁREA: Ciências Agrárias
ÁREA: Medicina Veterinária
RESUMO:
A leishmaniose é uma doença causada por protozoários do gênero Leishmania. Os gatos têm surgido como potenciais reservatórios de diferentes espécies de Leishmania, apesar de anteriormente serem considerados refratários à infecção. A maioria dos gatos infectados permanece saudável, possivelmente devido à sua resistência natural. A molécula gp63 é considerada um fator de virulência encontrada na superfície de promastigotas de todas as espécies de Leishmania. A gp63 é uma metalopeptidase de 63 kDa, que facilita a internalização do parasito em macrófagos, bem como sua nutrição, crescimento, diferenciação e escape do sistema imune. O objetivo do presente estudo foi investigar a presença de metalopeptidases, com ênfase na gp63, em promastigotas de Leishmania infantum isoladas de gatos naturalmente infectados na cidade de Teresina, Piauí. Promastigotas de L. infantum foram cultivados em meio Schneider suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Extratos celulares de promastigotas foram obtidos através da lise com Triton X-100 a 0,1% e subsequentemente usados para detectar a metalopeptidase gp63. O sobrenadante de cultivo livre de células foi concentrado em um sistema Centricon, utilizando uma membrana de 10 kDa. A atividade proteolítica dos extratos celulares e sobrenadantes de L. infantum foi avaliada utilizando o substrato peptídico fluorogênico Z-Phe-Arg-AMC a pH 10 por 60 minutos. No extrato celular, as cepas demonstraram uma atividade enzimática variando entre 2.600 e 100 Unidades Arbitrárias de Fluorescência (UAF). Já no sobrenadante, a atividade enzimática mensurada encontrou-se na faixa entre 800 e 100 UAF. Além disso, a presença de 1,10fenantrolina (um inibidor clássico de metalopeptidases) inibiu a atividade dessas enzimas, sugerindo que se tratavam de metalopeptidases. Realizamos ensaios zimográficos para evidenciar a atividade enzimática da gp63, utilizando SDS-PAGE com gelatina incorporada como substrato. Após eletroforese, os géis foram incubados em tampão pH 10,0 e pH 5,0 por 48 horas a 37°C, com ou sem 10 mM de 1,10-fenantrolina. No extrato celular e no sobrenadante, foi observada uma degradação proteolítica em torno de 63 kDa, correspondente à enzima gp63, previamente identificada e caracterizada em diversas espécies de Leishmania, com um pH ótimo de 5,0. A atividade enzimática no extrato celular foi completamente inibida na presença de 1,10-fenantrolina indicando, novamente, a natureza metalopeptidásica da enzima. Por outro lado, no sobrenadante, não foram detectadas atividades enzimáticas, provavelmente devido a quantidade reduzida desta enzima. A detecção de gp63 foi também realizada através de Western blotting usando o anticorpo anti-gp63, tanto no extrato celular quanto no sobrenadante. No extrato celular, foram observadas bandas com massas moleculares variando entre 45 a 100 kDa. Enquanto isso, no sobrenadante, as cepas apresentaram um perfil reativo com bandas entre 63 kDa e 120 kDa. Na análise por citometria de fluxo, promastigotas foram fixadas com paraformaldeído e incubadas com o anticorpo primário anti-gp63, seguido por incubação com anticorpo secundário conjugado a fluoresceína, para quantificar a expressão de gp63 nos diferentes isolados. A análise foi realizada tanto para a detecção da gp63 localizada na superfície celular quanto no interior da célula. Observou-se que o porcentual de células marcadas variou de 51% a 96% na superfície celular e de 46% a 95% no interior das promastigotas. Além disso, foi notada uma maior intensidade de fluorescência no interior celular entre 8000 a 2000 MIF, em comparação com a superfície celular que variou de 6000 a 2500 MIF. Em conclusão, nossos resultados indicam a presença de metalopeptidases com domínios homólogos à gp63 em promastigotas de L. infantum isolados de gatos. Essa descoberta aponta para potenciais implicações na virulência e na resposta imunológica do hospedeiro, destacando a importância deste estudo para uma compreensão mais aprofundada da leishmaniose em felinos.
Número de páginas: 62
MEMBROS DA BANCA:
Presidente - 026.006.647-85 - ANDRE LUIS SOUZA DOS SANTOS - UFRJ
Externo à Instituição - RAYSSA MARIA DE ARAÚJO CARVALHO - FACID
Externo à Instituição - VLADIMIR COSTA SILVA - FIOCRUZ
Cadastrada em: 19/04/2024
