O glifosato é agrotóxico de maior risco potencial para a saúde humana por ser o mais comercializado no mundo, no Brasil e no Piauí. Baseando-se nessa realidade, este estudo teve como objetivo avaliar a contaminação de leite materno pelo agrotóxico glifosato em puérperas atendidas em maternidades públicas do Piauí. Adotou-se desenho de estudo correlacional descritivo e de corte transversal aplicado nos municípios de Teresina com 164 participantes, Oeiras com 27 e Uruçuí com 13 participantes. Foi desenvolvido um método de análise laboratorial das amostras de leite materno aplicado à técnica de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a fotodiodo de detecção por radiação ultravioleta, mediante a reação de derivatização do glifosato e seu metabólito ácido aminometilfosfônico pelo cloroformato de 9-fluorenilmetila. Após testes experimentais o método escolhido para a análise das amostras de leite materno foi o gradiente isocrático com uso do solvente acetronitrila a 10%, testado em triplicata que ao passar pelo detector, este constatou a presença do glifosato em picos cromatográficos na faixa de 263 nanômetros(nm), com coeficiente de correlação(r) igual a 0,9993 que originou a construção da curva de calibração e a confirmação de sua eficiência e linearidade. Durante a fase de análise das amostras de leite materno ocorreu pane com substituição de coluna cromatográfica, limitando-se as análises à detecção e comprometendo tanto sua reprodutibilidade, como a quantificação das duas substâncias quando detectadas. Analisou-se 62,5% das amostras coletadas em Oeiras e Uruçuí, detectando-se presença de glifosato ou ácido aminometilfosfônico em 64% delas. Ao desagregar por município, comprovou-se contaminação em 46,1% e 83,4% das amostras analisadas provenientes de Oeiras e Uruçuí, respectivamente. Conclui-se que é alta contaminação do leite materno pelo glifosato, comprovando-se sua gravidade e importância enquanto fator de risco à saúde da mulher e da criança.